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小細胞之大奧妙
點擊次數:136 發布時間:2019-05-07

有經驗和剛剛從事細胞培養工作的人員都應該認真仔細地詢問下細胞提供方提供的建議,提前了解所要培養細胞的詳細資料,準備好細胞所要用到的培養基和相關試劑,雖然所有的貼壁,半貼壁或者懸浮細胞處理方式差不多,但是不同的實驗室培養條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在,也會導致對細胞處理不當,或者環境的不適應而造成細胞的死亡。

1.收到細胞,第一時間要鏡檢:觀察細胞形態是否正常,對于貼壁細胞則要注意看貼壁情況是否很好,觀察細胞密度,有疑議及時咨提供細胞的技術人員。由于運輸的時間或者溫度的變化,很多貼壁細胞在盛滿培養基的瓶子里生長的狀態和平時會有點不一樣,主要是貼壁牢固問題。比如293T,平時貼壁就不是很牢,在裝滿的培養基瓶子里面,會發生大片的脫落,細胞聚集在一起,但是細胞生長還是正常的,通過離心收集,加以胰酶的消化,重新打散,又可以正常的貼壁生長。

2.當通過上一步的觀察,細胞初步沒有任何問題時,進行下一步操作。當收到的細胞密達到80%左右時,則處理如下:棄除瓶中大部分培養基,僅保留5到10mL培養所需的常規培養基;或更換新鮮的培養基,置于培養箱中,隨后每天觀察。細胞在低于正常生長溫度情況下,會調整為靜止期,或者慢速生長期,必須恢復37度的環境至少3個小時左右,才能重新調整到接近對數生長期的狀態,在對數生長期進行細胞的傳代會大大增加傳代的成功率,和細胞的存活率。

3.如果經第一步觀察發現細胞密度超過90%,并且細胞狀態很好時,則復溫后2個小時需要立即傳代。傳代的比例應依據不同的細胞而定。對于生長比較快,狀態穩定,不易受外界影響的細胞可以一次多傳幾瓶;對于生長較慢,細胞比較薄,狀態容易波動的細胞類型,一次少傳些,保證每瓶細胞密度大些,便于穩定生長。至于一些比較陌生的細胞,第一次處理也可以依照第二種情況。

 

傳代操作:

1.吸除培養瓶內舊培養液。

2.加入無菌pbs洗液(5-8mL)輕輕潤濕細胞,稀釋多余的培養基,之后吸走洗液,動作要輕,不可吹打到細胞。

3.向瓶內加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許,以能覆滿瓶底為限。 

4.置溫箱中2~5分鐘,一旦鏡檢發現細胞質回縮,細胞間隙增大后,細胞變圓,比較松動后,立即終止消化。

5.加入該細胞對應的培養基6mL(T25培養瓶)或12mL(T75培養瓶)終止消化。

6.用吸管通過吸取的培養基輕輕反復吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時應盡量以最少的次數將細胞從壁上吹下,不僅要控制吹打的力度、次數,還要注意要將細胞盡可能吹成單個。這樣既能減少死細胞,又能便于細胞再次均勻貼壁生長。

7.依據傳代比例,將細胞懸液分瓶,再補充培養基后,靜置于溫箱培養,直止貼壁。

貼壁細胞在培養瓶長成致密單層后,繼續生長的空間不足,培養基中的營養成份也消耗較多,同時代謝廢物也有較多堆積,需要分瓶培養,對細胞進行傳代擴增。對于貼壁不太緊的細胞如293,可以直接吹散后分瓶。而對于貼壁較緊的細胞如CHO,則需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以筆者的經驗,以輕吹或加培養液后輕搖可下較好,但對于經驗不太充分的實驗者而言是較難判斷掌握的。

胰酶消化的程度是一個關鍵:消化過度則對細胞的活性影響較大,并有部分細胞漂浮,隨棄去的胰酶流失;消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下,反復吹打同樣也會損傷細胞活性。影響消化速度的因素較多,主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復凍融、解凍后存放時間及溫度等)、消化時的溫度(氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶會比不含的消化能力強很多,不同細胞對消化液的敏感性也不同,比如HEP-G2人肝癌細胞,該細胞消化時間可長達10分鐘左右。 消化時間仔細去摸索一下zui好,每過2分鐘鏡下觀察細胞是否變圓,記錄zui佳消化時間,下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。

對于懸浮細胞換液時只需要補液就行。

懸浮細胞的傳代則不需要用胰酶消化,直接通過計數算好傳代的比例,直接分瓶,補液。有些懸浮細胞趨于成團生長,此時細胞生長狀態良好,當補液時,避免吹打。典型實例:jurkat就是成團生長。當jurkat細胞密度比較大時,可將培養瓶豎直放置2分鐘左右,待大部分細胞沉下,吸走上層清液,補充等量的新鮮培養基。

 

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